Аутосомный тип наследования. Митохондриальное наследование Митохондриальная дисфункция

Явление гетероплазмии определяет существование в одной клетке нормальных митохондрий и митохондрий с нарушенной функцией. За счет первых клетка может функционировать какое-то время. Если продукция энергии в ней падает ниже определенного порога, то происходит компенсаторная пролиферация всех митохондрий, включая дефектные. В худшем положении оказываются клетки, которые потребляют много энергии: нейроны, мышечные волокна, кардиомиоциты.

Из-за утечки в дыхательной цепи митохондрии постоянно продуцируют свободные радикалы на уровне 1–2 % поглощенного кислорода. Количество продукции радикалов зависит от мембранного потенциала митохондрий, на изменения которого влияет состояние АТФ-зависимых калиевых каналов митохондрий. Открытие этих каналов влечет за собой возрастание образования свободных радикалов, повреждение других белков митохондриальных мембран и мтДНК. ДНК митохондрий не защищена гистонами и хорошо доступна для радикалов, что проявляется в изменении уровня гетероплазмии. Принято считать, что наличие 10 % митохондрий с измененной ДНК не оказывает влияния на фенотип.

4. КЛАССИФИКАЦИЯ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Единой этиологической классификации МЗ в настоящее время не существует из-за неопределенности вклада мутаций ядерного генома в их этиологию и патогенез. Существующие классификации основаны на 2-х принципах : локализации мутантного гена в мтДНК или яДНК и участии мутантного белка в реакциях окислительного фосфорилирования.

Этиологическая классификация (по, 2006) включает митохондриальные болезни, связанные с дефектами:

· мтДНК;

· яДНК;

· интергеномных взаимодействий.

Патогенетическая классификация (по, 2000) подразделяет митохондриальные болезни на обусловленные нарушением:

· карнитинового цикла;

· окисления жирных кислот;

· метаболизма пирувата;

· цикла Кребса;

· работы дыхательной цепи;

· сопряжения окисления и фосфорилирования.

В клинической практике объединяют комбинации часто встречающихся симптомов МЗ в синдромы.

Митохондриальные заболевания - гетерогенная группа заболеваний, характеризующихся генетическими и структурно-биохимическими дефектами митохондрий, нарушением тканевого дыхания. По происхождению МЗ делятся на первичные (наследственные) и вторичные.

Причинами наследственных МЗ являются мутации митохондриального и (или) ядерного генома.

К настоящему времени известно более 200 заболеваний, вызванных мутацией мтДНК.

По мере накопления клинико-диагностических данных в разных странах было установлено, что у детей примерно каждое третье наследственное метаболическое заболевание связано с митохондриями. По данным Н. Г. Даниленко, (2007) в популяциях частота митохондриальных болезней варьирует от 1:5000 до 1:35000. Минимальная частота МЗ в популяции взрослых жителей Великобритании оценивается как (1–3):10000.

Характеристика клинических особенностей МЗ представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Клинические особенности митохондриальных заболеваний (по, 2007)

Клинические особенности	Патофизиологическое значение
Полисистемность, полиорганность, «необъяснимость» сочетания симптомов со стороны органов, не связанных по происхождению	Поражение органов, имеющих близкий «порог» чувствительности к нарушению окислительного фосфорилирования
Наличие острых эпизодов в дебюте заболевания или в его развернутой стадии	«Метаболический криз», связанный со срывом баланса между потребностями ткани в энергообеспечении и уровнем анаэробного дыхания
Вариабельный возраст начала симптоматики (от 1 до 7-го десятилетия жизни)	Вариабельный уровень мутантной мтДНК в разных тканях в различный момент времени
Усугубление симптоматики с возрастом	Нарастание числа мутаций мтДНК и ослабление интенсивности окислительного фосфорилирования по мере старения

Поражение большинства систем и органов при МЗ можно объяснить тем, что многие процессы, протекающие в организме энергозависимы. Относительная энергозависимость органов и тканей в порядке убывания: ЦНС, скелетные мышцы, миокарда, орган зрения, почки, печень, костный мозг, эндокринная система.

Нейронам необходимо большое количество АТФ для синтеза нейромедиаторов, регенерации, поддержания необходимого градиента Na + и К+, проведения нервного импульса. Скелетные мышцы в покое потребляют незначительные количества АТФ, но при физической нагрузке эти потребности возрастают в десятки раз. В миокарде постоянно совершается механическая работа, необходимая для циркуляции крови. Почки используют АТФ в процессе реабсорбции веществ при образовании мочи. В печени происходит синтез гликогена, жиров, белков и других соединений.

5. ДИАГНОСТИКА МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Митохондриальные болезни трудны для диагностики. Определяется это отсутствием строгой связи между сайтом мутации и клиническим фенотипом. Это значит, что одна и та же мутация может вызывать разные симптомы, а один и тот же клинический фенотип могут формировать разные мутации.

Поэтому для постановки диагноза митохондриального заболевания важен комплексный подход, основанный на генеалогическом, клиническом, биохимическом , морфологическом (гистологическом), генетическом анализах.

Генеалогический анализ

Наличие в семейном анамнезе синдрома внезапной младенческой смерти, кардиомиопатий, деменций, раннего инсульта, ретинопатий, диабета, задержки развития может указывать на митохондриальную природу имеющегося заболевания.

Клинические проявления митохондриальных заболеваний

Миопатический синдром : слабость и атрофия мышц, снижение миотонического тонуса, мышечные боли, непереносимость физической нагрузки (усиление мышечной слабости, появление рвоты и головной боли).

Центральная нервная система и органы чувств: летаргия, кома, задержка психомоторного развития, деменция, нарушение сознания, атаксия, дистония, эпилепсия, миоклонические судороги, «метаболический инсульт», слепота центрального происхождения, пигментный ретинит, атрофия зрительных нервов, нистагм, катаракта, офтальмоплегия, птоз, нарушение остроты зрения, гипоакузия, дизартрия, сенсорные нарушения, сухость слизистой рта, гипотония, снижение глубоких сухожильных рефлексов, инсультоподобные эпизоды, гемианопсия.

Периферическая нервная система: аксональная нейропатия, нарушение двигательной функции гастроинтестинального тракта.

Сердечно-сосудистая система: кардиомиопатия (обычно гипертрофическая), аритмия, нарушение проводимости.

Желудочно-кишечный тракт: частые диспептические явления (рвота, диарея), атрофия ворсинок кишечника, экзокринная недостаточность поджелудочной железы.

Печень: прогрессирующая печеночная недостаточность (особенно у младенцев), гепатомегалия.

Почки: тубулопатия (по типу синдрома Де Тони-Дебре-Фанкони: фосфатурия, глюкозурия, аминацидурия), нефрит, почечная недостаточность.

Эндокринная система: задержка роста, нарушение полового развития, гипогликемия, сахарный и несахарный диабет, гипотиреоз, гипопаратиреоидизм, гипоталамо-гипофизарная недостаточность, гиперальдостеронизм.

Система кроветворения: панцитопения, макроцитарная анемия .

Основные биохимические проявления митохондриальных заболеваний

Повышение уровня:

· лактата и пирувата в крови (ликворе);

· 3-гидроксимасляной и ацетоуксусной кислот в крови;

· аммиака в крови;

· аминокислот;

· жирных кислот с разной длиной цепи;

· миоглобина;

· продуктов перекисного окисления липидов;

· мочевой экскреции органических кислот.

Снижение:

· активности некоторых ферментов энергетического обмена в митохондриях;

· содержания общего карнитина в крови.

Лактатный ацидоз является практически постоянным спутником митохондриальных болезней, но проявляется и при других формах патологии. Поэтому более эффективным является измерение уровня лактата в венозной крови после умеренной физической нагрузки на велоэргометре.

Основные изменения структуры скелетной мышцы при митохондриальной недостаточности

Морфологическое исследование позволяет с помощью световой и электронной микроскопии в сочетании с гистохимическими методами выявить нарушения количества и строения митохондрий, признаки их дисфункций и снижения активности митохондриальных ферментов.

C ветовая микроскопия с применением различных видов специальной окраски, в т. ч. и для определения активности митохондриальных ферментов выявляет:

· феномен «рваных» (шероховатых) красных волокон (RRF - « ragged » red fibres ) в количестве более 5 % (при окраске по Гомори, Альтману напоминает разрыв волокон по периферии и обусловлен скоплением пролиферирующих генетически измененных митохондрий под сарколеммой);

· гистохимические признаки недостаточности митохондриальных ферментов (цикла Кребса, респираторной цепи), особенно цитратсинтетазы, сукцинатдегидрогеназы и цитохром-С-оксидазы;

· субсарколеммальное накопление гликогена, липидов, кальция (считают, что накопление жировых капель в различных тканях, в т. ч. в мышечных волокнах, происходит в результате нарушения окисления жирных кислот в митохондриях).

При электронной микроскопии определяют:

· пролиферацию митохондрий;

· скопления аномальных митохондрий под сарколеммой;

· полиморфизм митохондрий с нарушением формы и размера, дезорганизацией крист;

· наличие в митохондриях паракристаллических включений;

· наличие митохондриально-липидных комплексов.

Генетический анализ для подтверждения диагноза митохондриального заболевания

Обнаружение любого вида митохондриальной мутации с достаточно высоким соотношением аномальной и нормальной мтДНК подтверждает диагноз митохондриального заболевания или синдрома. Отсутствие митохондриальной мутации позволяет предполагать у пациента наличие патологии, связанной с мутацией яДНК.

Известно, что уровень гетероплазмии во многом определяет фенотипическое проявление мутации. Поэтому, при проведении молекулярного анализа необходимо оценивать количество мутантных мтДНК. Оценка уровня гетероплазмии включает детекцию мутации, однако методы обнаружения мутации не всегда учитывают уровень ее гетероплазмии.

1. Метод клонирования дает достоверные количественные результаты (наиболее трудоемкий и продолжительный).

2. Флуоресцентная ПЦР предоставляет более точные результаты при меньшей трудоемкости (не позволяет выявлять мелкие делеции и вставки).

3. Денатурирующая высокоразрешающая жидкостная хроматография дает воспроизводимые результаты при любых видах мутаций (делеции, вставки, точковые мутации), находящихся в состоянии гетероплазмии (оценка уровня гетероплазмии более точна по сравнению с 2-мя предыдущими).

4. ПЦР в реальном времени используется для обнаружения и количественной оценки мутаций мтДНК. Используют: гидролизуемые зонды (TaqMan ), интеркалирующий краситель SYBR .

Наиболее точные оценки дают 3 метода:

· минисеквенирование ( SNaP - shot ) - определение однонуклеотидных замен, делеций и инсерций короткими зондами (15–30 нуклеотидов). Участок ДНК несущий мутацию, например C T выделяется и аплифицируется с помощью ПЦР. Этот участок является матрицей. Зонд имеет идентичную структуру, массу 5485 Да, но короче матрицы на один нуклеотид. К смеси зонда и матрицы добавляют нуклеотиды Т и С. Если к зонду присоединится нуклеотид С, то матрица «дикого» типа и ее масса составит 5758 Да. Если нуклеотид Т - матрица была мутантного типа с массой 6102 Да. Затем массу полученных образцов определяют с помощью масс-спектрометра.

· Пиросеквенирование - сочетание секвенирования и синтеза. Матрицу инкубируют в смеси из 4-х ферментов, 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP , d СТ P , dG Т P , d ТТ P ) и 4-х терминаторов транскрипции dNTP . Присоединение комплементарного нуклеотида сопровождается флуоресцентной биохимической реакцией.

· Biplex Invader - позволяет обнаруживать сразу 2 мутации .

Однако, при сопоставимой точности Biplex Invader оказался наиболее простым в использовании, а SNaPshot - наиболее дорогостоящим.

В настоящее время предпочтение отдается чиповым технологиям , позволяющим анализировать основные патогенные мутации мтДНК сразу во множестве образцов, устанавливая при этом уровень гетероплазмии каждой отдельной мутации.

Алгоритм диагностики митохондриальных заболеваний (по , 2007)

1. Необходимо доказательное клиническое подозрение на наличие митохондриальной болезни. В типичных случаях это может быть выявление клинической картины, характерной для той или иной формы митохондриальной энцефаломиопатии (MELAS, MERRF и т. д.), однако «классические» варианты этих фенотипов встречаются сравнительно редко.

Выявление общепринятых лабораторных маркеров митохондриальной дисфункции, мультисистемного, полиорганного поражения (для этого необходим соответствующий целенаправленный поиск), а также материнского типа наследования указывают на митохондриальную природу болезни.

2. Исследование мтДНК в лимфоцитах (у пациентов с четкими фенотипами MELAS, MERRF, атрофией зрительных нервов Лебера). При выявлении искомой мутации диагноз конкретной митохондриальной болезни может считаться подтвержденным.

3. При отсутствии выявляемых мутаций в лимфоцитах проводят биопсию скелетной мышцы (обычно четырехглавой или дельтовидной), т. к. скелетная мышца является более надежным источником мтДНК (отсутствие клеточных делений в мышце способствует «удержанию» митохондрий, содержащих мутантную мтДНК). Образцы мышечных биоптатов делят на 3 части: одна - для микроскопического исследования (гистология, гистохимия и электронная микроскопия), вторая - для энзимологического и иммунологического анализа (изучение характеристик компонентов дыхательной цепи), третья - для молекулярно-генетического анализа.

4. При отсутствии известных мутаций мтДНК в мышечной ткани проводят развернутый молекулярно-генетический анализ - секвенирование всей цепи мтДНК (или кандидатных генов ядерной ДНК) с целью выявления нового варианта мутации.

5. Идентификация конкретного биохимического дефекта в том или ином звене дыхательной цепи митохондрий является альтернативой изучения скелетной мускулатуры.

6. ЛЕЧЕНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

В настоящее времени митохондриальные забо­левания практически не излечимы. Однако возможно либо отсрочить развитие заболевания, либо избежать наследования патогенной митохондриальной мутации.

Принципы терапии митохондриальных заболеваний

1. Симптоматическое лечение:

Диета составляется в зависимости от патогенеза.

· При патологии транспорта и окисления жирных кислот рекомендуется частое и дробное питание со снижением калорийности пищи.

· При нарушении обмена пировиноградной кислоты для восполнения дефицита ацетил-Ко-А используется кетогенная диета.

· При дефиците ферментов ЦТК применяется частое кормление.

· При дефиците дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования снижают количество углеводов.

Медикаментозная терапия.

· Препараты, активизирующие перенос электронов в дыхательной цепи (коэнзим Q 10 , витамины К1 и К3, препараты янтарной кислоты, цитохром С).

· Кофакторы энзимных реакций энергетического обмена (никотинамид, рибофлавин, карнитин, липоевая кислота и тиамин).

· Средства, уменьшающие степень лактат-ацидоза (дихлорацетат, димефосфон).

· Антиоксиданты (убихинон, витамин С и Е).

Исключение препаратов, ингибирующих энергообмен (барбитураты, хлорамфеникол).

ИВЛ, противосудорожные препараты, ферменты поджелудочной железы, переливание компонентов крови.

Список сокращений.

(ATP) АТФ - аденозинтрифрсфат

(mtDNA) мтДНК - митохондриальная ДНК

(ox-phos) ОФ - окислительное фосфорилирование

(NADH) НАД-Н - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид

(FADH) ФАД-Н - востановленный флавинадениндинуклеотид

(TCA) ТКК - трикарбоновые кислоты

(ЕТС) ЦПЭ - цепь передачи электронов

(PDH) ПДГ - пируватдегидрогеназа

(CoA) КоА - коэнзим А

(ТРР) ТПФ - тиаминпирофосфат

(ADP) АДФ - аденозиндифосфат

(ROS) РФК - реактивные формы кислорода

(MnSOD) Mn-СОД - Mn- супероксиддисмутаза

(ZnSOD) Zn-СОД - Zn-супероксиддисмутаза

(GPX) ГП - глутатионпероксидаза

(PRX) ПР - пероксидредоксин

(mtNOS) мтСОА - митохондриальная синтаза оксида азота

(TNF α) ФНОα - фактор некроза опухолей α

(NF-kappa β) ЯФ-каппа β- ядерный фактор- каппа β

(ppm) чнм - частей на миллион

(SDH) СДГ - сукцинатдегидрогеназа

(COX) ЦОК - цитохром-с-оксидаза

(IU) МЕ - международная единица (мера вещества)


Митохондрии выполняют роль электростанций в наших клетках. Они отвечают за создание энергии в форме аденозинтрифосфата (АТФ) и участвуют в путях передачи сигналов апоптоза. Имеющаяся в настоящее время теория гласит, что митохондрии являются потомками аэробных бактерий, которые колинизировали древних прокариот около 1-3 миллионов лет назад ;

5-й комплекс - митохондриальная Н + -АТФаза (состоит из 12-14 субъединиц, осуществляет синтез АТФ).

Кроме того, электроны 4 жирных кислот, подвергающихся бета-окислению, переносит электронпереносящий белок.

В митохондриях осуществляется ещё один важный процесс - бета-окисление жирных кислот, в результате которого образуется ацетил-КоА и эфиры карнитина. В каждом цикле окисления жирных кислот происходят 4 энзиматические реакции.

Первый этап обеспечивают ацил-КоА-дегидрогеназы (коротко-, средне- и длинноцепочечные) и 2 переносчика электронов.

В 1963 г. было установлено, что митохондрии имеют собственный уникальный геном, наследуемый по материнской линии. Он представлен единственной небольшой кольцевой хромосомой длиной 16 569 п.н., кодирующей 2 рибосомальные РНК, 22 транспортные РНК и 13 субъединиц ферментных комплексов электронно-транспортной цепи (семь из них относятся к комплексу 1, один - к комплексу 3, три - к комплексу 4, два - к комплексу 5). Большинство митохондриальных белков, участвующих в процессах окислительного фосфорилирования (около 70), кодируются ядерной ДНК и лишь 2% (13 полипетидов) синтезируются в митохондриальном матриксе под контролем структурных генов.

Строение и функционирование мтДНК отличается от ядерного генома. Во-первых, она не содержит интронов, что обеспечивает высокую плотность генов по сравнению с ядерной ДНК. Во-вторых, большинство мРНК не содержит 5"-3"-нетранслируемые последовательности. В-третьих, мтДНК имеет D-петлю, которая представляет собой её регуляторную область. Репликация представляет собой двухступенчатый процесс. Выявлены также отличия генетического кода мтДНК от ядерной. Особо следует отметить, что существует большое число копий первой. Каждая митохондрия содержит от 2 до 10 копий и более. Учитывая тот факт, что клетки могут иметь в своём составе сотни и тысячи митохондрий, возможно существование до 10 тыс. копий мтДНК. Она весьма чувствительна к мутациям и в настоящее время идентифицировано 3 типа таких изменений: точковые мутации белков, кодирующих мтДНК-гены (mit- мутации), точковые мутации мтДНК-тРНК-генов (sy/7-мутации) и крупные перестройки мтДНК (р-мутации).

В норме весь клеточный генотип митохондриального генома идентичен (гомоплазмия), однако при возникновении мутаций часть генома остаётся идентичной, а другая - изменённой. Такое явление называется гетероплазмиеи. Проявление мутантного гена происходит тогда, когда количество мутаций достигает определённого критического уровня (порога), после чего наступает нарушение процессов клеточной биоэнергетики. Это объясняет то, что при минимальных нарушениях в первую очередь будут страдать наиболее энергозависмые органы и ткани (нервная система, головной мозг, глаза, мышцы).